Materiales y Metodos Olivos al microscopio II: Reproducción.

      Como ya hemos indicado uno de nuestros objetivos es poner a disposición del profesorado técnicas que puedan realizarse con materiales caseros. Aunque en las páginas anteriores se muestran algunos detalles hemos creído conveniente crear una página en la que se detallen todos los aspectos necesarios para su realización. A continuación mostraremos imágenes y explicaciones de las mismas junto con un enlace a un documento PDF que recoge, a modo de cuaderno de laboratorio, todas las técnicas y experiencias realizadas. Todos los materiales han sido adquiridos en comercios de la localidad, salvo el formol que lo compramos en Amazon.

Fijación/inclusión en resina de poliéster.

     Para poder cortar, o en nuestro caso reducir el grosor mediante el lijado, es necesario que el material biológico esté embebido en un medio de cierta dureza, como es la parafina o en nuestro caso la resina de poliéster. Para ello son necesarios los siguientes pasos:

1. Cortar las muestras a tamaño muy pequeño (a menor tamaño mejor penetrabilidad de las sustancias empleadas en el proceso).
2. Fijación de la muestra con algún líquido, como el formol, que preserve las estructuras.
3. Sustituir el agua del interior de la muestra por el medio de inclusión. Como el agua y el medio de inclusión no son miscibles es necesario realizar los siguientes pasos:
   1. Deshidratación. En varios pasos sustituiremos el agua por alcohol.
   2. Sustitución del alcohol por otro disolvente que sea miscible con el medio de inclusión, en nuestro caso acetona.
   3. Sustitución de la sustancia puente por el medio de inclusión.
4. Preparación de bloques. Colocación de las muestras en moldes llenos del medio de inclusión.

Ver imágenes.

Obtención de preparaciones.

1. Desmoldar los bloques y fragmentar el bloque para separar las piezas que contenga.
2. Tallado de la pieza de forma que la cara deseada presente la mayor superficie posible.
3. Lijado de esa cara hasta, pulido y pegado al portaobjetos.
4. Acabado de la muestra.

Ver imágenes.

Otras técnicas.

Preparación del epicarpo de la aceituna mediante ebullición.

     Para facilitar el desprendimiento del epicarpio podemos sumergir las aceitunas en agua hirviendo. El sistema no es tan fácil ni tan rápido como en el tomate, pero permite despegar porciones de epicarpio de tamaño aceptable que pueden visionarse directamente sobre un porta. El material tiende a enrollarse por lo que puede ser conveniente dejarlo secar entre dos portas si queremos montarlo con laca o cualquier medio de montaje.

Ver imágenes.

Pegado directo con pegamento rápido.

     Los materiales duros, como el hueso de aceituna, pueden montarse directamente sobre el porta. Para hacerlo debemos lijar y pulir la cara que vayamos a pegar y una vez pegada reducir hasta el grosor deseado mediante lijas de agua. En nuestro caso hemos englobado la muestra pegada con pegamento de dos componentes para reforzar la muestra para el lijado y pulido final.

     También hemos probado con materiales blandos como flores o mesocarpio de aceitunas. Para el mesocarpio cortamos la aceituna con un cuchillo afilado y echamos sobre la superficie del corte pegamento instantáneo. El pegamento impregna la pulpa y cuando seca permite tratar la zona endurecida como si hubiésemos realizado una inclusión. Los resultados no son buenos pero permiten obtener algunas imágenes de forma muy fácil.

Ver imágenes.

Observación de tubos polínicos.

     En general pensamos que el grano de polen es un gameto, pero en realidad tanto el grano de polen como el saco embrionario son “plantas” denominadas gametofitos que forman parte del ciclo reproductor. Nuestra intención es explicar en detalle como el grano de polen genera un tubo que conducirá el material genético hasta el gameto femenino. Queremos conseguir imágenes de granos de polen germinados in vitro, para observar el tubo polínico, si bien es verdad que el proceso es algo complicado y no sabemos si podremos ponerlo a punto.
     Como en la fase preparatoria (marzo y abril) no encontraremos con facilidad flores de olivo pensamos iniciar el estudio con jazmines, otra planta de la familia de las oleáceas. Las condiciones de aislamiento en casa ocasionadas por el decreto del "Estado de Alarma" nos dificultan de momento obtener flores de jazmín, por lo que realizaremos los ensayos previos sobre polen de tulipán de nuestro jardín, que presenta un grano de polen ligeramente mayor que el de olivo.

En los ensayos previos nos hemos encontrado con dos problemas:
1. Preparación de un medio de cultivo adecuado, constituido por compuestos de fácil adquisición.
2. Concentración de granos de polen tras su inmersión en el medio de cultivo.

     Para las primeras observaciones hemos utilizado una disolución acuosa de sacarosa y hemos concentrado los granos de polen por decantación y centrifugación casera que podemos ver en las siguientes imágenes. Para ver el proceso en detalle puede consultarse el documento de materiales y métodos, que citábamos anteriormente.

Ver imágenes.

Fijación/inclusión en resina de poliéster.
Materiales utilizados en la fijación.	Moldes de alumninio empleados para la inclusión.	Es aconsejable incluir un número en cada bloque para identificar las muestras.
Si queremos evitar los olores de los bloques que acabemos de polimerizar en el horno podemos encerrarlos en un frasco de vidrio.	Horno de cocina con un bote en cuyo interior hay un bloque sin polimerizar totalmente.	Si queremos evitar los olores de los bloques durante su polimerización podemos encerrarlos en un recipiente hermético.
Desmoldado y preparación de la pieza.		Recorte final y pegado al porta.
Obtención de preparaciones.
Lijado y pulido final. (I)	Lijado y pulido final.(II)	Lijado y pulido final.(III)
Hueso inmaduro.	Semilla	Hueso maduro
Msocarpio.	Mesocarpio	Endocarpio inmaduro.
Endocarpio inmaduro.	Pétalo	Pétalo
Otras técnicas.
Preparación del epicarpo de la aceituna mediante ebullición.
Pegado directo con pegamento rápido.
Observación de tubos polínicos.
Decantación		Comparativa centrifugado.
¿Tubo polínico?	Casos dudosos