Olivos
al microscopio II: Reproducción. |
(*)
INTRODUCCIÓN.-
Adaptación al formato virtual.
Como hemos mencionado en la página principal del proyecto, pretendemos tener imágenes microscopicas de todos los órganos del olivo, procedentes de tres fuentes diferentes: Preparaciones "caseras", "profesionales" y obtenidas de publicaciones. Lo más probable, es que en esta ocasión nos limitemos a las preparaciones "caseras", a las imágenes publicadas y algunos modelos tridimensionales basado en las imágenes obtenidas; aunque no descartamos la posibilidad de añadir imágenes de las que denominamos "profesionales" si a lo largo del proyecto conseguimos la colaboración necesaria.
En "Olivos al microscopio II: Reproducción" nos centraremos en el estudio de los órganos reproductores del olivo y en la aceituna como resultado de los procesos encaminados a la reproducción.
Aunque es posible
que a medida que desarrollemos el proyecto surjan otras actividades,
inicialmente pensamos realizar preparaciones y algún modelo de los órganos
implicados en la reproducción o el resultado de ésta.
Nuestro objetivo principal es que los visitantes
se hagan conscientes de las características histológicas de las
partes del olivo estudiadas y de su relación con aspectos agrícolas
e industriales.
Las flores del olivo son pequeñas
y poco vistosas, en algunas ocasiones nos hemos ocupado de sus aspectos macroscópicos
pero hemos realizado pocas observaciones miscroscópicas de las flores
y prácticamente ninguna de la aceituna. Como el pasado año dividiremos
el proyecto en tres apartados: Preparaciones, modelos e imágenes publicadas.
Preparaciones:
Para conseguir nuestro objetivo de poner a disposición
del profesorado técnicas de fácil realización, tenemos
previsto experimentar con algunas descritas en la bibliografía especializada
y otras de desarrollo personal. En relación con estas últimas
vamos a comenzar con un sistema empleado en geología pero del que no
tenemos ninguna referencia de su aplicación en materiales biológicos.
La denominaremos "Técnica de inclusión en resina y pulido".
Debido a que el olivo no florecerá hasta poco tiempo antes de la celebración de la Feria, iremos poniendo a punto todas las técnicas con materiales congelados del año pasado. Nuestra intención es repetir la mayoría de las preparaciones con material fresco para sustituir las imágenes por otras de mayor calidad, aunque no tenemos seguridad de poder completarlo antes de la Feria.
Técnica de inclusión en resina y pulido
Para la realización de preparaciones de rocas, normalmente se siguen los siguientes pasos:
- Cortar una sección de la roca de aproximadamente 1 mm de espesor.
- Pulir una de las caras de dicha sección.
- Pegar la sección a un portaobjetos por la cara pulida
- Reducir la sección mediante lijado hasta reducirla a unas 50 micras de espesor.
- Pulir la cara para eliminar todas las marcas del lijado.
En nuestro caso procederemos de la forma siguiente:
- Corte de las muestras a pequeño tamaño y fijado de las mismas.
- Deshidratación de la muestra.
- Inclusión en resina de poliéster.
- Corte de una sección de la muestra de aproximadamente 1 mm de espesor.
- Pulido de una de las caras de dicha sección.
- Pegado de la sección a un portaobjetos por la cara pulida
- Redución de la sección mediante lijado hasta reducirla al espesor adecuado.
- Pulido de la cara para eliminar todas las marcas del lijado.
- Pintado con laca de uñas incolora para corregir imperfecciones y arañazos.
Al tratarse de una técnica de la que no existen referencias hemos creído conveniente realizar una experiencia previa consistente en probar con una muestra de material biológico previamente incluida en resina según técnicas de amplia utilización en microscopía electrónica. El material biológico, del que dispongo inclusiones en resina, es el correspondiente a mi tesis doctoral, realizada sobre piel de anfibios y reptiles. En la tabla siguiente presentaremos algunas imágenes junto con las descripciones correspondientes.
Éste
era el aspecto inicial de los bloques empleados para la prueba. Se trata
de fragmentos de piel dorsal de un sapo (Epidalea calamita (=Bufo calamita))
fijados con glutaraldehido y tetróxido de osmio. El color oscuro
de las muestras se debe al efecto de tinción del tetróxido
de osmio. A partir de este bloque se cortaron dos pequeños fragmentos,
que contenían la muestra, con la ayuda de una tenaza de bordes
afilados. |
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Estos fragmentos se alisaron y pulieron (1) por una de sus caras y posteriormente se pegaron a un porta. En el caso de la muestra superior se utilizó pegamento instantáneo y posteriormente se englobó en una gota de pegameno de dos componentes (resina epoxi). La muestra inferior se fijo únicamente con dicha resina. No se observó ninguna diferencia entre ellas debida a la fijación. (1) Se utilizó lija de agua del número 320 para el alisado, y de 400 y finalmente de 1200 para el pulido. El pulido final se realizó empleando aceite en lugar de agua. |
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Aspecto
de las dos muestras en las fases iniciales. En la de la derecha todavía
se aprecian las estrías de la fase de alisado. |
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Con iluminación
por reflexión se observa el brillo producido por la capa de melanóforos
e iridóforos, que se disponen bajo la epidermis. |
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A medida que avanza el proceso empiezan a distinguirse diferentes estructuras. En estas imágenes se aprecian desde arriba hacia abajo las siguientes:
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En estas
imágenes pueden observarse las ramificaciones dendríticas
que poseen los melanóforos |
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Aspecto
final de la muestra y detalle de la epidermis. |
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Las
imágenes de la tabla que figura debajo proceden de mi tesis,
habiéndose obtenido de preparaciones correspondientes a secciones
de diferentes grosores realizadas con un ultratomo LKB III. Las imágenes
se tomaron con un microscopio modelo "Universal Zeiss". |
La imagen siguiente corresponde a un pétalo tratado con esta técnica.
En la página "Materiales y métodos" puede ampliarse la información y los resultados obtenidos con esta técnica.
Otras técnicas más simples.
Adherido sobre cinta adhesiva y pegado sobre el porta, con el material todavía congelado. | ||
Adherido sobre cinta adhesiva y pegado sobre el porta, con el material descongelado y a temperatura ambiente. | ||
Inmersión de la aceituna en agua hirviendo y retirada de la piel. | ||
Impregnación y pegado directo con pegamento instantáneo. | ||
Modelos.
Los modelos tridimensionales son más fáciles
de interpretar que las preparaciones, ya que nos permiten apreciar la disposición
espacial de las estructuras. Todavía no hemos decidido los modelos que
realizaremos, pero probablemente serán dos:
Estos modelos se realizarán a escala empleando básicamente porexpán de alta densidad,
Imágenes de Internet.
Además de las preparaciones y modelos de
realización propia, procederemos a un rastreo de imágenes publicadas,
ya sea en revistas especializadas o en Internet.
Dispondremos de microscopios y preparaciones para que los visitantes puedan observar las estructuras, y materiales para que los que lo deseen puedan realizar las preparaciones.
En esta página
describiremos las técnicas de preparación y algunas imágenes, si bien la mayor
parte de éstas las dispondremos en otra página a la que podrá accederse mediante
el enlace situado bajo la tabla siguiente.
La mayoría de las imágenes se han realizado con
el microscopio
Biolux y la cámara incorporada que describíamos en la página anterior. En
las imágenes tomadas con otros medios se indicará con un número entre paréntesis
correspondiente al medio utilizado. La primera imagen realizada con un instrumento
incluirá un enlace para enlazar con la imagen del mismo de la página anterior.
La
observación de granos de polen es bastante fácil, ya que
pueden observarse directamente sobre el porta o fijarlos mediante cualquier
técnica simple. En este caso se utilizaron láminas de
plastificado instantáneo. Los granos de polen del olivo son de forma ovoide, casi esferoidales, y con relieves muy marcados en su superficie. Posee tres hendiduras longitudinales que facilitan su apertura. |
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Zona de inserción de los órganos reproductores en el centro de los pétalos. | ||
Los
pétalos y el estilo se encuentran recubiertos de tricomas, similares
a los descritos en el proyecto del pasado curso, como puede observarse
en estas dos imágenes. |
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El estilo posee unos resaltes a modo de nervaduras longitudinales. | ||
En la aceituna podemos distinguir el pericarpio y la semilla. A su vez el pericarpio está dividido en tres partes:
En esta imagen podemos ver el aspecto del epicarpio visto desde el exterior de la aceituna. |
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El mesocarpio Se dispone debajo del epicarpio y representa la mayor parte del volumen de la aceituna. Sus células son redondeadas y poseen en la madurez una gran gota de aceite, y otras mucho más pequeñas presentes en sus cloroplastos. |
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El endocarpio El hueso ocupa la zona central de la aceituna
y su tamaño es variable dependiendo de la variedad. |
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La semilla posee un epitelio que recibe el nombre de tegumento y en su interior encontramos el embrión y un tejido nutricio, el endospermo. | ||
El endospermo Es un tejido triploide, ya que se forma por la unión de los dos núcleos polares del saco embrionario y uno de los núcleos del grano de polen. |
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El embrión.
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La flor del olivo es blanca y de pequeño tamaño. Su cáliz formado por cuatro sépalos soldados adquiere la forma de un cilindro con cuatro pequeñas expansiones que le dan un aspecto ligeramente festoneado. Su corola está formada por cuatro pétalos en cruz que en su base se sueldan en un tubo de escasa longitud. Posee dos grandes estambres de filamento corto, y un pistilo central cuyo estigma presenta dos lobulos. |
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Estas flores nos serviran de base para la construcción del modelo.
NOTA.- Aunque las flores se suelen ajustar a la descripción anterior no es demasiado raro encontrarnos con flores pentámeras. |
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Comenzamos
creando la corola recortando los cuatro pétalos a partir de una
lámina de espuma para embalaje. Los pétalos poseen un nervio central y algunos laterales que discurren más o menos paralelamente al borde. Para la realización de estas nerviaciones hemos pegado alambres en el envés mediante pegamento de tipo "no más clavos". Estos alambres nos permitirán modificar la forma del pétalo y construir con la base de los mismos el tubo del que estos nacen. |
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Este tubo lo hemos pegado sobre un cilindro de porexpan de alta densidad que nos servirá de base para todos los elementos de la flor. | ||
Su cáliz, formado por cuatro sépalos soldados, adquiere la forma de un cilindro con cuatro pequeñas expansiones que le dan un aspecto ligeramente festoneado. | ||
En
esta imagen podemos observar los materiales que utilizaremos para fabricar
el cáliz. Es necesario emplear una banda elástica de refuerzo
para que al tirar de la lámina de espuma no se rasgue por las
escotaduras. |
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Hemos
pegado la zona picada en la base del cilindro que nos sirve de soporte
para que los extremos de los "sépalos" queden adosados
a los "pétalos". Posteriormente se han disimulado las
uniones con masilla acrílica. Se han exagerado los extremos de los sépalos para resaltar el carácter tetramero de esta flor. |
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Finalmente se ha lijado, y pintado con pintura acrílica. En la base del caliz se ha fijado un pequeño pedúnculo de porexpan mediante un tornillo que lo atraviesa. | ||
Posee
dos grandes estambres de filamento corto, y un pistilo central cuyo estigma
presenta dos lobulos. |
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Los
filamentos se han fabricado con un trozo de espuma de embalaje redondeadño
en cuyo interior se ha introducido un alambre para facilitar su forma
y permitir que sostenga el peso de las anteras. Éstas se han
realizado con dos láminas finas de espuma de embalaje. |
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Tras unir las dos partes formando un saco. | ||
Posteriormente
se han pintado con pintura de caucho de color rosado y espolvoreado
con cúrcuma con la pintura todavía fresca. Posteriormente
se han rellenado con semillas de mijo, pequeñas y de forma esférica,
teñidas con pintura acrílica amarillo-naranja, que simularán
granos de polen. Para
que estas semillas permanecieran en las anteras se pulverizaron con
cola de carpintero diluida. Este mismo procedimiento se utilizó
para la fijación de "granos de polen" en el exterior. |
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El
pistilo presenta al principio un estilo largo y delgado que termina
en un estigma bífido con abundantes papilas (detalle
tomado de la imagen de entrada al proyecto). |
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El
pistilo se ha hecho con porexpan de alta densidad, y láminas
de espuma de embalaje y alambre para los lóbulos del estigma
(recuadro). Finalmente se han pintado con pintura acrílica .
Se ha representado en una fase más avanzada en la que el óvulo
ya debe haber sido fecundado (lóbulos más marcados que
en la realidad). El hueco central del estilo se ha revestido con algunos filamentos de "musgo" para belenes teñidos con cola diluida y colorante alimentario para simular las papilas. |
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Para realizar las papilas se procedió de la forma siguiente:
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Modelo acabado. |
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En general pensamos que el grano de polen es un gameto, pero en realidad tanto el grano de polen como el saco embrionario son plantas denominadas gametofitos que forman parte del ciclo reproductor. El ciclo del olivo, como el de todas las plantas, consta de dos fases, una haploide (gametofito(1)) y otra diploide (esporofito(2)). Nuestra intención es explicar en detalle este proceso sirviéndonos de la maqueta y de la cartelería. Procedencia de la imagen de base para la maqueta. Reseña nº 4. Notas (1 y 2) En otras plantas, como musgos y helechos la diferencia no es tan enorme. En la cartelería veremos ejemplos para explicar detalladamente todo esto. |
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Esta maqueta, como la mayoría la realizaremos básicamente con porespán de alta densidad. Partiremos de una plancha de 6 cm de grueso y cortaremos dos bloques de 32x15 cm (1). Es conveniente unir provisionalmente los bloques, ya que debemos cortar y lijar y queremos que la maqueta quede homogénea cuando esté cerrada. Para conseguir esta unión provisional vamos a colocar unos tornillos a los que les hemos quitado la cabeza y un pegamento que pueda ser eliminado fácilmente. Procederemos según los pasos siguientes:
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Con las dos piezas pegadas hay que darles la forma adecuada.
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Para el tubo polínico hemos utilizado un tubo de una mascarilla respiratoria desechable.
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Detalle indicando los componentes más importantes del proceso. |
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Para
que los visitantes puedan situarse facilmente contaremos con este modelo
de una aceituna elaborado por nuestr@s alumn@s para el proyecto presentado
en la 5ª Feria de la Ciencia. En este
enlace puede verse el detalle de la construcción. |
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A partir del modelo anterior vamos a elaborar nuestro modelo a escala microscópica. Lo realizaremos con una plancha de 6 cm de grosor de porexpán de alta densidad. El tamaño completo del modelo tendrá aproximadamente medio metro, treinta centímetros para el pericarpio y veinte para la semilla. |
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Lo
realizaremos con una plancha de 6 cm de grosor de porexpán de
alta densidad. El tamaño completo del modelo tendrá aproximadamente
medio metro, treinta centímetros para el pericarpio y veinte
para la semilla.Comenzaremos recortando las piezas con un cuchillo de
cocina y modelándola a continuación con bloques de lija. |
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El pericarpio, que es la parte del fruto que envuelve a la semilla consta de tres partes:
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Intentaremos reproducir la forma y características de las células de cada zona. Nos basaremos en las imágenes de los recuadros, que pueden verse, así como sus procedencia en la página de micrografías. Evidentemente no podemos representarlo a escala, ya que para que las células del mesocarpio tuviesen ese tamaño una tapa de aceitunas no cabrían en un campo de fútbol. |
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Epicarpio. Está formado por células aplanadas de forma poligonal, y en nuestro modelo ocupa algo más de un centímetro en la zona superior, correspondiente al exterior de la aceituna. Sobre esta capa celular de dispone una cutícula que fabricaremos con barniz al alcohol del utilizado para manualidades. |
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Mesocarpio. Dispuesto bajo el anterior representa aproximadamente el 60% de la sección de una aceituna y algo menos en nuestro modelo (aproximadamente 20 cm). Lo hemos representado con 5 o 6 capas de células para mostrar su morfología. Estas células son redondeadas y poseen en la madurez una gran gota de aceite. En sus cloroplastos, situados en la periferia, podemos encontrar gotas de aceite de tamaño mucho menor |
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Endocarpio. El hueso ocupa en la realidad
el 40% restante, pero en nuestro modelo se ha exagerado para poder representar
las características de su pared (algo más de 10cm en el
modelo) y la semilla que se aloja en el interior. |
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El paso siguiente
es marcar todos los límites celulares con un soldador para que
queden bien definidos cuando pintemos el modelo. |
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Ahora deberemos
pintar las llagas que marcan los límites celulares. Utilizaremos
pintura marrón oscura para el endocarpo y verde para el resto
de las capas. |
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Cuando la pintura
de las llagas que marcan los límites celulares esté seca
pintaremos con colores, similares a los anteriores pero más claros,
el interior de todas las estructuras. Escurriremos muy bien el pincel
para que la pintura no caiga en el interior de las ranuras. |
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El paso siguiente
será dibujar en el interior de las células los componentes
más importantes: gotas de aceite (que en la madurez ocuparán
casi toda la célula), núcleos y algunos cloroplastos. |
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En esta imagen
pueden verse los detalles del interior de las células del mesocarpo
destacando las grandes gotas de aceite, algunos núcleos y varios
cloroplastos. En el interior de estos últimos se han señalado
algunas gotitas minúsculas de aceite. |
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Finalmente crearemos una cutícula sobre la superficie del epicarpio. Para crearla hemos utilizado
barniz al alcohol para manualidades, ya que el barniz clásico
disolvería el porexpan. También podría haberse
utilizado barniz acrílico. |
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El contacto
entre el endospermo y el embrión se ha representado con trazo
irregular, ya que, a diferencia de las demás partes, no se corresponde
con una disposición concéntrica. |
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En
el modelo dejaremos un espacio, en el color original del porexpan, para
indicar su separación respecto al endospermo, y representaremos
dos embriones para indicar la existencia en algunos casos de dos semillas
en el interior del hueso. Debe quedar claro que es una forma de representación
y que puede haber dos semillas en el interior del hueso, pero nunca
dos embriones en el interior de una semilla.
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Tegumento. Capa externa de la semilla con función protectora, en ella se distinguen una zona exterior o testa y otra interior o tegmen En nuestro modelo no representaremos estas diferencias. |
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Tejido nutricio o endospermo. Al igual que en la representación del mesocarpio, alteraremos la escala para poder representar las características de las células. Éstas están repletas de pequeñas gotitas de aceite y algunos acumulos proteicos de mayor tamaño, en algunos casos podremos observar sus núcleos. |
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Embrión. Como ya hemos mencionado, hemos representado dos embriones para que desde cualquier punto de vista puedan observarse las zonas desde las que se dará lugar a cada parte de la futura planta:
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Como hemos hecho en el pericarpio marcaremos los límites celulares con un soldador para que queden bien definidos y pintaremos las llagas que los marcan. Utilizaremos pintura marrón oscura para el tegumento y el endospermo y azul para el embrión. |
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Cuando la pintura
de las llagas esté seca pintaremos con colores, similares a los
anteriores pero más claros, el interior de todas las estructuras.
Escurriremos muy bien el pincel para que la pintura no caiga en el interior
de las ranuras. |
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En el endospermo
dibujaremos en el interior de las células los componentes más
importantes: pequeñas gotas de aceite (que en la madurez ocuparán
casi toda la célula), núcleos y depósitos protéicos. |
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En esta imagen
pueden verse los detalles del interior de las células del mesocarpo
destacando las grandes gotas de aceite, algunos núcleos y varios
cloroplastos. En el interior de estos últimos se han señalado
algunas gotitas minúsculas de aceite. |
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Este es el aspecto final del modelo, en el que aparecen rotulados todos sus elementos. | ||
Imágenes directas (Macro o microscopio) Obtenidas con el microscopio digital correspondiente al nº (7) |
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Procedencia de las imágenes:
Profesores implicados:
Juan Jiménez Pérez
(Antiguo miembro del Grupo de Trabajo de Ciencias Naturales de Arahal-Paradas,
creador de los materiales originales)
y
Carlos Zamorano
Leal
(Antiguo coordinador del Proyecto Olivar y Escuela y actual Webmaster de esta
página).
Fotografía de M.C. Fernández, obtenida del libro "El cultivo del olivo"
Como ya publicamos en la página
de novedades, debido a problemas de salud tuvimos que interrumpir la
preparación de actividades y finalmente suspender nuestra participación
en la 17ª edición de la Feria de la Ciencia. Una vez superado el
periodo de reposo asociado a la intervención retomamos el proyecto, que
esperábamos estuviera acabado para la presente edición. Con la
aparición del Covid-19 nos encontramos con que la 18ª Feria de la
Ciencia será virtual y por tanto habrá que adaptar las actividades
a esta modalidad. Esto probablemente traerá como consecuencia que el
próximo año volveremos a repetir el proyecto, a ver si como dice
el refrán: "a la tercera va la vencida".
Este
año comenzamos en el punto en que se interrumpió el proyecto,
continuando con la elaboración de modelos, ahora modificaremos las actividades
para adaptarlas al nuevo formato.
Dejaremos el proyecto previsto para esta edición sin modificar e incorporaremos las actividades y materiales de nueva creación al proyecto correspondiente a la 18ª edición de la Feria de la Ciencia, y para la 19ª que esperemos pueda celebrarse en mayo de 2021. El enlace siguiente abrirá una página similar a ésta pero en el estado en el que quedó el proyecto para la feria de 2019.